Реферат: Цисплатина

Нещодавно до клітин мишиної лімфоми R1.1, резистентних до дії цисплатина були одержані антитіла, які реагували з глікопротеідом з молекулярною масою 200кД, гіперекспресованим на поверхні цих клітин. Кількість білка на клітинній поверхні знаходилась у зворотній залежності від акумулювання цисплатина у клітинах та корелювала з рівнем їх чутливості до цисплатина. Було запропоновано, що даний білок може бути аналогом Р-глікопротеіда (Pgp) і є непрацездатним каналом, що гіперекспресований на клітинній поверхні для компенсації дефектної функції [33].

В резистентних до цисплатина клітинах з підвищеним вмістом глутатіона часто спостерігається гіперекспресія ГS-Х-помпи. В цитоплазматичних везикулах таких клітин знаходиться більше кон`югатів ГS-Pt, ніж в чутливих клітинах [34]. Така внутрішньоклітинна компартменталізація ліків та продуктів їх метаболизму також вважається одним з механізмів лікарської резистентності. В багатьох випадках резистентні пухлинні клітини відрізняються розвинутою везикулярною сіткою, що дозволяє їм просторово нейтралізувати токсини та виводити їх шляхом екзоцитозу.

В експериментах з використанням бутионінсульфоксиміна (BSO), інгібітора синтезу глутатіона, було показано, що при витощенні внутрішньоклітинного глутатіона активність ГS-Х-помпи лише трохи зменшується [35]. Таким чином, ефективність транспорту ГS-Pt-кон`югатів визначається не тільки концентрацією останніх, а й експресією переносника.

Останнім часом з`явилися роботи, що засвідчують, що білок, асоційований з загальною лікарською резистентністю (MRP але не Pgp) може функціонувати як ГS-Х-помпа [36,37]. Ця гіпотеза підтверджується такими фактами: 1) клітини, що гіперекспресують MRP секретують у культуральне середовище більше глутатіона; 2) витощення внутрішньоклітинного глутатіона за допомогою BSO запобігає виведенню ліків з клітин за допомогою MRP; 3) гіперекспресія MRP відповідає підсиленому АТФ-залежному транспорту кон`югатів ГS-Х; 4) антитіла до MRP реагують з білком з молекулярною масою 190 кД, який може зв`язуватись з ГS-кон`югатами та лейкотрієном С4.

Таким чином, видалення з клітин комплексів глутатіон-S-платина переносниками з активністю ГS-Х-помпи є важливим механізмом резистентності, завдяки якому внутрішньоклітинна концентрація препарату підтримується на низькому рівні, що сприяє зменшенню його пошкоджуючого ефекту.

4.2.Внутрішньоклітинні тіолові детоксикуючі системи

4.2.1. Система глутатіона

Глутатіон та ферменти його метаболізму є важливими елементами меxанізму резистентності клітин до алкілуючих агентів, в тому числі сполук платини.

Більшість клітинних ліній, резистентних до дії цисплатина відрізняються підвищеним вмістом внутрішньоклітинного глутатіона та/чи гіпреактивністю фермента, що ініціює синтез глутатіона g-глутамілцистеінсинтетази (g-ГЦС) [38-40]. Однак описані приклади стійких до дії цисплатина клітинних ліній з нормальним [41,42] та зниженим [43] у порівнянні з чутливими лініями вмістом глутатіона.

Сучасні стереоскопічні та спректроскопічні методи дозволили визначити, що глутатіон та цисплатин реагують безпосередньо у безклітинній системі в молярному співвідношенні 2/1, утворюючи хелатний комплекс диглутатіонплатини. Після 12 годин інкубації клітин в середовищі з цисплатином концентрація ГS-Pt-кон`югатів стає максимальною. При цьому 60% внутрішньоклітинної платини знаходиться у зв`язаному стані [10].

Заслуговують на увагу дані, отримані в експериментах з використанням інгібітора синтезу глутатіона бутіонінсульфоксиміна (BSO). Обробка BSO клітинних ліній раку шлунка людини MKN-28 та MKN-45 , раку яєчника КК та МН, аденокарциноми ротової порожнини КВ призводить до сенсибілізації клітин до дії цисплатина [44,45]. Причому витощення внутрішньоклітинного глутатіона за допомогою BSO не впливало на акумулювання цисплатина в клітинах а також формування кон`югатів GSH-Pt [46].

При вивчeнні взаємодії ферментів метаболізму глутатіона та їх ролі в механізмах резистентності велике значення мають експерименти з використанням культур клітин, трансфекованих генами відповідних ензимів. Наприклад, клітини раку легенів людини, трансфековані геном фермента g-ГЦС, мають у 2 рази більше глутатіона, в 1,6 рази підвищену активність ГS-Х-помпи та в 1,5 рази меньшу акумуляцію цисплатина, в 6,7 рази більшу резистентність до цисплатина у порівнянні з батьківською клітинною лінією. Витощення внутрішньоклітинного глутатіона в трансфектах за допомогою BSO не впливало на резистентність до цисплатина. У таких випадках зберіглась висока активність ГS-X-помпи і тому внутрішньоклітинна концентрація платини не змінилася. Таким чином, в даній клітинній системі резистентність обумовлена посиленим видаленням ГS-Pt-конюгатів за допомогою ГS-Х-помпи, що не загубила своєї активності навіть при витощенні субстрата (глутатіона) [47].

В той же час не винайдено ніякого зв`язку між рівнем експресії глутатіонредуктази та глутатіонпероксидази та ступенем стійкості клітин до дії цисплатина [48,49].

4.2.2.Металотеонеіни

Особлива роль у формуванні резистентності відводиться металотеонеінам.

Оскільки у вільному стані ці сполуки нуклеофільні, металотеонеіни зв`язуються з електрофільними протипухлинними препаратами типу цисплатина, а також мелфаланом та деякими антибіотиками: адріаміцином, блеоміцином та доксорубіцином.

Клітини, що гіперексперсують металотеонеіни, часто резистентні до дії цисплатина [50,51]. Однак металотеонеін не є обов`язковим компонентом резистентності до цього препарату, оскільки зустрічаються резистентні до цисплатина клітинні лінії, в яких металотеонеін не виявляється [43].

При обробці цисплатином резистентних до препарата клітин з підвищеним вмістом металотеонеіна 70% внутрішньоклітинної платини знаходять у зв`язаному з білком стані.

Досліди по трансфекції гена металотеонеіна ІІа показали, що клітини-трансфекти набувають резистентності до цисплатина, хлорамбуцила та мелфалана [52].

Добре виражена експресія металотеонеіна в пухлинах може мати прогностичне значення. Наприклад, при лікування хворих на рак стравоходу за допомогою цисплатина 5-річна життєздатність пацієнтів з металотеонеін-від`ємними пухлинами становить 56%, а пацієнтів з металотеонеін-позитивними пухлинами – 26% [53].

З наведених вище даних можна заключити, що у випадках підвищеної експресії металотеонеін є важливою складовою резистентності до цисплатина.

4.3.Репарація пошкоджень ДНК.

Резистентність клітин до дії цисплатина може залежати від стану системи репарації пошкоджень ДНК.

Один з механізмів резистентності клітин до цисплатину – прискорена репарація цисплатин-ДНК-адуктів [54]. Чутливі до дії цисплатина клітинні лінії відрізняються зниженою здатністю ліквідувати основні адукти ДНК та цисплатина (GG-Pt та GA-Pt), а також послабленою активністю ДНК-полімераз [55,56]. Обробка резистентних до цисплатина клітин афідикоіном – інгібітором ДНК-полімераз a та b повертає чутливість до цисплатина, що стверджує роль репарації адуктів цисплатин-ДНК у формуванні резистентності [57].

На сьогодні мало відомо, щодо ліквідації продуктів платинування ДНК у мітохондріях. Вважають, що мітохондріальна ендонуклеаза G (Endo G) може брати участь у репаративних процесах цих органел [58].

Нещодавно з культуральної рідини пухлинних клітин та біопсійного матеріалу пухлин людини були виділені білки HMG (high-mobility group) та їм подібні, які зв`язуються з ДНК, що пошкоджена цисплатином, але не трансплатином чи ультрафіолетовим випроміненням [59,60]. Ці білки – висококонсервативні, локалізуються у цитоплазмі та ядрі клітини. Їх біологічна роль ще точно не встановлена. Інтенсивність зв`язування ДНК з цисплатином та HMG-подібними білками прямо пропорційна ступеню пошкодження ДНК. ДНК резистентних клітин зв`язується з цими білками більш ефективно. HMG-білки взаємодіють з платинованою ДНК, закривають пошкоджені сайти від ферментів ексцизійної репарації. Припускають, що зв`язування HMG-подібних білків з пошкодженою ДНК може викликати зупинку реплікації чи транскрипції, а також впливати на роботу систем контролю клітинного циклу при руйнуванні ДНК.

Відомо, що такі дефекти системи репарації невідповідностей (mismatch repair), як недостатня експресія білків hMSH2 чи hMLH-1, призводять до виникнення резистентності до цисплатина [61,62]. MSH2-білок сам по собі чи разом з білком GTBP/p160 розпізнає невеликі зміни у ланцюгу ДНК, наприклад, продукти платинування ДНК, і зв`язується з ними.

Априорі можна було б припустити, що відсутність якої-небудь частини системи репарації ДНК сприяє розвитку гіперчутливості до дії цисплатина, що відбувається у клітинах, дефектних за системою ексцизійної репарації. Але у випадку порушення функції системи mismatch repair клітина набуває резистентності до цисплатина. Цей феномен можна розглядати з двох позицій. По-перше, порушення системи mismatch repair може бути наслідком індукованого цисплатином випадкового мутагенезу, що в результаті обумовлює стійкість до дії цисплатина. По-друге, саме дефект у роботі цієї системи репарації може покласти початок резистентності [63,64].

Комплекс білків репарації “розпізнає” адукти у ланцюгу-шаблоні ДНК та намагається виправити ланцюг, що синтезується [65]. Так, поки існує адукт у ланцюгу-шаблоні, а підбір нових основ не ліквідує невідповідність, що існує, генерується сигнал, який запускає програму апоптозу. Якщо система mismatch repair не працює, такий сигнал не генерується, клітини стають толерантними до адуктів цисплатин-ДНК та набувають резистентного фенотипу.